DSPath 4X One-Step Multiplex Master Mix 實(shí)驗方案 1

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針對猴痘病毒（Monkeypox virus, MPXV）的定性實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應（Real-time PCR）檢測：

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1. 研究背景與目的

- 猴痘病毒（MPXV）是正痘病毒屬（Orthopoxvirus, OPXV）的一種，自天花根除以來(lái)，已成為由OPXV引起的最嚴重疾病。

- 2022年全球猴痘疫情的爆發(fā)促使需要增加臨床測試的診斷能力。

- 研究目的是驗證一種定性的OPXV實(shí)時(shí)PCR檢測方法，并描述其在臨床實(shí)驗室診斷MPXV的分析性能。

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2. 材料與方法

2.1 分析性能實(shí)驗材料

- 使用含有合成MPXV DNA的通用轉運介質(zhì)（UTM）或病毒轉運介質(zhì)（VTM）進(jìn)行實(shí)驗。

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2.2 DNA提取

- 使用核酸提取儀器進(jìn)行自動(dòng)化核酸提取。

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2.3 實(shí)時(shí)TaqMan PCR檢測

- 總反應體積：20 μL（包含5 μL的模板和15 μL的主混合液）。

- 主混合液成分：

??- 5 μL DSPath 4X One-Step Multiplex Master Mix （GDSBio, V5005）。

??- 7 μL dH2O。

??- 1 μL 正向引物（10 nm）。

??- 1 μL 反向引物（10 nm）。

??- 1 μL 探針（5 nm），針對OPXV目標序列。

- 臨床樣本測試：當加入內控時(shí)，dH2O的體積減少至4 μL，以允許加入1 μL的正向和反向引物（各10 nm）和探針（5 nm），針對人類(lèi)RNAseP基因。

- 實(shí)時(shí)PCR操作：使用Prism 7500序列檢測系統（Applied Biosystems），并按照以下循環(huán)條件進(jìn)行：

??- 1個(gè)循環(huán)：95.0°C持續2分鐘。

??- 40個(gè)循環(huán)：95.0°C持續3秒，60.0°C持續31秒。

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在這項實(shí)驗中，實(shí)時(shí)PCR是用來(lái)檢測和定量猴痘病毒DNA的。使用的TaqMan化學(xué)方法是一種常用的熒光定量PCR技術(shù)，它可以在PCR擴增過(guò)程中實(shí)時(shí)監測DNA的累積量。通過(guò)這種方式，可以準確測定病毒DNA的濃度，從而幫助診斷猴痘病毒感染。

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以下是實(shí)驗中使用的引物和探針序列：

1. OPXV目標的引物和探針序列：

???- 正向引物(F): `TCAACTGAAAAGGCCATCTATGA`

???- 反向引物(R): `GAGTATAGAGCACTATTTCTAAATCCCA`

???- 探針(P): `FAM-CCATGCAATATACGTACAAGATAGTAGCCAAC`

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2. 人類(lèi)RNAseP基因作為內控的引物和探針序列：

???- 正向引物(F): `AGATTTGGACCTGCGAGCG`

???- 反向引物(R): `GAGCGGCTGTCTCCACAAGT`

???- 探針(P): `Cy5–TTCTGACCTGAAGGCTCTGCGCG`

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3. 首月測試中得到的陽(yáng)性患者樣本也在內部使用基于研究的猴痘特異性PCR進(jìn)行了檢測，使用的引物和探針序列（針對B6R基因）：

???- 正向引物(F): `ATTGGTCATTATTTTTGTCACAGGAACA`

???- 反向引物(R): `AATGGCGTTGACAATTATGGGTG`

???- 探針(P): `FAM-AGAGATTAGAAATA`

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2.4 檢測限（LOD）

- 通過(guò)將MPXV DNA稀釋至不同濃度并檢測，確定LOD。

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2.5 可重復性

- 使用100個(gè)拷貝/mL的MPXV陽(yáng)性樣本和陰性UTM/VTM評估可重復性。

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2.6 特異性

- 測試已知陽(yáng)性患者樣本，包括單純皰疹病毒1型、2型等，以確定特異性。

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2.7 一致性

- 使用88個(gè)盲樣（包括陰性和不同濃度的陽(yáng)性樣本）進(jìn)行測試。

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這個(gè)實(shí)驗方案詳細地描述了從樣本收集、核酸提取、實(shí)時(shí)PCR檢測到結果分析的全過(guò)程。

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DSPath?4X One-Step Multiplex?Master Mix

貨號：V5005，V5006

產(chǎn)品簡(jiǎn)介

DSPath?4X One-Step Multiplex Master Mix是用于一步法多重熒光定量PCR的試劑。它以探針和特異性引物來(lái)定量檢測RNA或DNA靶標序列。優(yōu)化的緩沖液組分可以協(xié)助在一個(gè)體系內完成多達4個(gè)RNA或DNA序列的多重定量PCR。該混合液以4倍濃度提供，能夠加入更多的模板進(jìn)行反應，從而提高檢測的靈敏度。

產(chǎn)品用途

探針?lè )ǘ嘀鼗虮磉_分析

產(chǎn)品特點(diǎn)

全預混，使用方便

可同時(shí)檢測多個(gè)靶標

高靈敏度，檢測低拷貝基因

耐受臨床樣本抑制劑

含防污染系統，減少交叉污染