1 PCR產(chǎn)物的電泳檢測時(shí)間
　　一般為48h以?xún)?，有些最好于當日電泳檢測，大于48h后帶型不規則甚致消失。

2 假陰性，不出現擴增條帶，應該怎么辦？
　　PCR反應的關(guān)鍵環(huán)節有①模板核酸的制備，②引物的質(zhì)量與特異性，③酶的質(zhì)量及用量， ④PCR循環(huán)條件。尋找原因亦應針對上述環(huán)節進(jìn)行分析研究。

3 出現假陽(yáng)性怎么辦？
　　出現的PCR擴增條帶與目的靶序列條帶一致，有時(shí)其條帶更整齊，亮度更高。
　　引物設計不合適：選擇的擴增序列與非目的擴增序列有同源性，因而在進(jìn)行PCR擴增時(shí)，擴增出的PCR產(chǎn)物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出現假陽(yáng)性。需重新設計引物。
　　靶序列或擴增產(chǎn)物的交叉污染：這種污染有兩種原因：一是整個(gè)基因組或大片段的交叉污染，導致假陽(yáng)性。這種假陽(yáng)性可用以下方法解決：操作時(shí)應小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內或濺出離心管外。除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外，所有試劑或器材均應高壓消毒。所用離心管及進(jìn)樣槍頭等均應一次性使用。必要時(shí)，在加標本前，反應管和試劑用紫外線(xiàn)照射，以破壞存在的核酸。二是空氣中的小片段核酸污染，這些小片段比靶序列短，但有一定的同源性?？苫ハ嗥唇?，與引物互補后，可擴增出PCR產(chǎn)物，而導致假陽(yáng)性的產(chǎn)生，可用巢式PCR方法來(lái)減輕或消除。

4 出現非特異性擴增帶怎么辦？

PCR擴增后出現的條帶與預計的大小不一致，或大或小，或者同時(shí)出現特異性擴增帶 與非特異性擴增帶。非特異性條帶的出現，其原因：一是引物與靶序列不完全互補、 或引物聚合形成二聚體。二是Mg2+離子濃度過(guò)高、退火溫度過(guò)低，及PCR循環(huán)次數 過(guò)多有關(guān)。其次是酶的質(zhì)和量，往往一些來(lái)源的酶易出現非特異條帶而另一來(lái)源的酶 則不出現，酶量過(guò)多有時(shí)也會(huì )出現非特異性擴增。其對策有：必要時(shí)重新設計引 物。減低酶量或調換另一來(lái)源的酶。降低引物量，適當增加模板量，減少循環(huán)次 數。適當提高退火溫度或采用二溫度點(diǎn)法(93℃變性，65℃左右退火與延伸)。

4.1 怎樣檢測引物是否合成的好？

可以在DHPLC上看一下，80度全變性的情況下一條帶就可以了。如果合成的不好，產(chǎn)物自然不特異了。

4.2 使用了比較好的Taq酶，且引物沒(méi)有出現問(wèn)題，考慮如下幾點(diǎn)：
　　1。模板是否過(guò)量？
　　2。退火溫度是否可降高1－2度？
　　3。Mg的濃度控制在1.5mM?

5 出現片狀拖帶或涂抹帶怎么辦？
　　PCR擴增有時(shí)出現涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶。其原因往往由于酶量過(guò)多或酶的質(zhì)量 差，dNTP濃度過(guò)高，Mg2+濃度過(guò)高，退火溫度過(guò)低，循環(huán)次數過(guò)多引起。其對策有：減少酶量，或調換另一來(lái)源的酶。②減少dNTP的濃度。適當降低Mg2+濃 度。增加模板量，減少循環(huán)次數。