1、從柱離心式產(chǎn)品的流行看經(jīng)典方法的缺點(diǎn) （或者操作重點(diǎn)）

柱式方法的風(fēng)行是無(wú)法否定的現實(shí)。下面通過(guò)柱式方法與經(jīng)典方法的比較，看一看如何注意經(jīng)典方法的操作重點(diǎn)。

裂解，二者幾乎沒(méi)有任何區別。去蛋白質(zhì)，柱式靠的是柱材料對蛋白質(zhì)吸附力低這一特點(diǎn)，將蛋白質(zhì)殘留控制在比較低的水平 (并不是/也不能徹底去除)；經(jīng)典方法最常用的是 PC 抽提，可以將蛋白質(zhì)去除得更徹底一些。其它大分子雜質(zhì) - 如多糖等 - 的去除，柱式的與蛋白質(zhì)的去除相似，但經(jīng)典方法中卻沒(méi)有如此方便的對應方法。小分子物 (鹽等) 的去除，是柱式方法最優(yōu)勢所在。如果柱子設計沒(méi)有問(wèn)題，離心后柱子中殘留的液體穩定而少；柱式的洗滌具有“流水洗滌”的效果；柱式中的核酸是不成團塊的 - 這三個(gè)特點(diǎn)決定了柱式的洗滌效率比經(jīng)典的洗滌效率高，所以，柱式純化的核酸純度比較高。

2、 應該使用多少菌液？

根據我們的經(jīng)驗，如為高拷貝質(zhì)粒（如：pUC118等），使用2 ml培養液與4 ml培養液純化的質(zhì)粒DNA的收量差別不是很大，可以純化到20-25 μg的高純度質(zhì)粒DNA。如提取地拷貝質(zhì)?；虼笥?0 kb質(zhì)粒，建議使用5-10 ml的菌液（可分幾管收集菌體，按比例加入溶液Ⅰ、溶液Ⅱ、溶液Ⅲ，再將離心上清分批轉移至DNA純化柱），吸附和洗脫的時(shí)間可以適當延長(cháng)，洗脫時(shí)使用的溶液Eluent應在60℃水浴預熱。高純度質(zhì)粒小提試劑盒所配硅膠柱的最大吸附量是40 μg，滿(mǎn)足絕大多數實(shí)驗所需用量。

3、溶液Ⅰ、溶液Ⅱ、溶液Ⅲ的用量問(wèn)題

溶液Ⅰ、溶液Ⅱ、溶液Ⅲ的比例是固定的，如果增加或減少用量都請按比例變化，但是一般來(lái)說(shuō)，用量原則是確保能徹底裂解樣品，同時(shí)使裂解體系中核酸的濃度適中（具體表現是加入溶液Ⅱ后，能形成澄清的裂解溶液）。濃度過(guò)低，將導致沉淀效率低，影響得率；濃度過(guò)高，去除雜質(zhì)的過(guò)程復雜且不徹底，導致純度下降。溶液的用量是以樣品中蛋白質(zhì)的含量為基準的，而不是以核酸含量為基準。

4、 溶液Ⅱ操作時(shí)要注意的事項

在反應液充分的時(shí)候，第一，反應的時(shí)間不能過(guò)長(cháng)，長(cháng)時(shí)間的堿性條件會(huì )打斷DNA，基因組DNA一旦發(fā)生斷裂，只要是50－100 kb大小的片斷，就沒(méi)有辦法再被溶液Ⅲ沉淀了；第二，不得激烈振蕩，不然基因組DNA也會(huì )斷裂最后得到的質(zhì)粒上總會(huì )有大量的基因組DNA混入，瓊脂糖電泳可以觀(guān)察到一條濃濃的總DNA條帶。

5、質(zhì)粒質(zhì)量檢測

將抽提好的核酸直接用于后續的實(shí)驗，是唯一可靠的檢測方法；除此之外的檢測方法，都是相對的，而且并不十分可信。目前用于正式實(shí)驗前檢測核酸質(zhì)量的方法，一是電泳，二是紫外分光光度儀。電泳檢測的主要是核酸的完整性和大小，只要核酸不是太小或者太大 (超出電泳分離范圍)，該方法還是非?？尚诺?；電泳還可以用于估計核酸的濃度，但其準確度與經(jīng)驗有關(guān)；另外，電泳也可能提供某些雜質(zhì)污染的信息，但是同樣與經(jīng)驗有關(guān)。紫外分光光度儀檢測的是純度和核酸含量，然而，由于紫外分光光度儀不能確保非常準確，而該儀器的靈敏度又非常高，所以，提供的結果并不十分可信。一般講，同時(shí)進(jìn)行紫外和電泳檢測，綜合二者的結果，可以做出一個(gè)更合理的判斷。但由于這兩個(gè)方法都有缺陷，所以，即使出現壞的結果能用于后續實(shí)驗而好的結果卻不能用于后續實(shí)驗，也不用大驚小怪。

6、 質(zhì)粒電泳條帶

瓊脂糖電泳進(jìn)行鑒定質(zhì)粒DNA時(shí)，多數情況下你能看到三條帶，但不要認為你看到的是超螺旋、線(xiàn)性和開(kāi)環(huán)這三條帶。堿法抽提得到質(zhì)粒樣品中不含線(xiàn)性DNA，用EcoRI來(lái)線(xiàn)性化質(zhì)粒后再進(jìn)行瓊脂糖電泳，就會(huì )看到線(xiàn)性質(zhì)粒DNA的位置與這三條帶的位置不一樣。其實(shí)這三條帶以電泳速度的快慢而排序，分別是超螺旋、開(kāi)環(huán)和復制中間體（即沒(méi)有復制完全的兩個(gè)質(zhì)粒連在了一起）。如果你不小心在溶液II加入后過(guò)度振蕩，會(huì )有第四條帶，這條帶泳動(dòng)得較慢，遠離這三條帶，是20-100kb的大腸桿菌基因組DNA的片斷。 非常偶然的是，有時(shí)候抽提到的質(zhì)粒會(huì )有7－10條帶，這是由于特殊的DNA序列導致了不同程度的超螺旋（超螺旋的圈數不同）所致。

7、 核酸的保存

純化后的核酸，最后多使用水或者低濃度緩沖液溶解；其中 RNA 以水為主，DNA 則多以弱堿性的 Tris 或者 TE 溶解。經(jīng)典的 DNA 溶解方法多提倡使用 TE 溶解，認為 EDTA 可以減少 DNA 被可能殘留下來(lái)的 DNase 降解的風(fēng)險；如果操作過(guò)程控制得當，DNase 的殘留幾乎是可以忽略的，完全可以直接使用 Tris 或者水 (pH 接近 7) 溶解 DNA?；旧?，核酸在保存中的穩定性，與溫度成反比，與濃度成正比。

如果溫度合適，保存中核酸發(fā)生降解或者消失，首要原因是酶殘留導致的酶解，第二個(gè)原因則是保存核酸溶液的 pH 值不合適導致的水解 (RNA 在弱酸性更穩定，而 DNA 在弱堿性更合適)。還有一個(gè)不為人重視的，就是 EP 管對核酸的影響。首先一定要堅信一點(diǎn)，那就是核酸一定會(huì )與裝它的容器的接觸面發(fā)生反應，達到某種均衡。EP 管的材質(zhì)，首先可能吸附核酸，其次還可以誘導核酸的結構發(fā)生某些變化，如變性。在核酸的濃度比較高時(shí)，這個(gè)現象可能觀(guān)察不到；當核酸濃度很低時(shí)，則比較明顯了。在低濃度的核酸中加入 Geletin,Glycogen,BSA 可以穩定核酸，雖然已經(jīng)為實(shí)驗所證明，但許多實(shí)驗人員并沒(méi)有將該建議當回事?，F在制造 EP 管的材料遠多于過(guò)去。這些新出現的材料，在強度、透明度等物理特征方面可能比原來(lái)的純 PP 材質(zhì)要好許多，但其化學(xué)特征，尤其是對核酸穩定性的可能影響，遠沒(méi)有研究透徹。正如現在的質(zhì)?？梢愿脑斓迷絹?lái)越適用某些要求一樣，其負面產(chǎn)物可能是，抽提的質(zhì)粒電泳的構型越來(lái)越多：除了原來(lái)的三種帶型外，還可能出現 denatured cc 、multimeric forms of cc 等等帶型。

8、 核酸抽提中的溫度問(wèn)題

核酸抽提中的溫度問(wèn)題，也是一個(gè)值得關(guān)注的問(wèn)題。首先要明確的一點(diǎn)是，任何一個(gè)溫度條件，對某些方面有利，同時(shí)也一定會(huì )有不利的一面。如沉淀，低溫操作會(huì )提高得率，但也會(huì )增加雜質(zhì)的殘留。任何一步操作該用什么溫度為好，應該是利弊權衡的結果?；旧?，除了一些特殊的步驟，如消化等外，用室溫是最好的選擇。低溫的確可以減低酶的活性，但低溫同時(shí)也降低了這些酶被裂解液中的試劑滅活或者抑制的速度，此消彼長(cháng)，沒(méi)有辦法給出結論的。