FS? Mix Direct for Tissue

Cat. #：P2071b，P2072b

產(chǎn)品簡(jiǎn)介

FS??Mix Direct for Tissue是適合組織樣本擴增的2×濃縮快速高效PCR預混合溶液，含有FS? Taq DNA聚合酶、dNTP混合物、緩沖液等PCR擴增必需組分（模板與引物除外）。使用時(shí)，僅需在擴增體系中加入簡(jiǎn)單處理后的樣本處理液和引物即可進(jìn)行PCR，從而可以極大地簡(jiǎn)化操作過(guò)程，縮短操作時(shí)間，降低污染（加樣次數減少）。FS??Mix Direct for Tissue的反應體系經(jīng)過(guò)優(yōu)化處理，高靈敏度的FS??Taq DNA聚合酶確保處理液中的微量樣本得到高效擴增。本產(chǎn)品不用進(jìn)行繁瑣的DNA提取，最大限度減少實(shí)驗誤差和交叉污染；同時(shí)依靠特殊的緩沖體系增強PCR擴增的特異性，保證擴增效果與DNA模板擴增效果同樣可靠。

FS??Taq DNA聚合酶是根據蛋白工程原理，以Taq DNA聚合酶為基礎，研發(fā)設計的新一代DNA聚合酶。本產(chǎn)品具有類(lèi)似KOD酶的快速擴增能力，延伸速度為20s/kb（70~75℃，簡(jiǎn)單模板可達5s/kb）。是普通Taq DNA聚合酶的3倍，可縮短一半以上的擴增時(shí)間；同時(shí)具備Taq DNA聚合酶擴增效率高、適應性廣等優(yōu)點(diǎn)。FS??Taq DNA聚合酶使用方法與普通Taq DNA聚合酶基本相同，只需注意適當縮短延伸時(shí)間。該酶具有5'→3'聚合酶活性，無(wú)3'→5'外切酶活性。擴增產(chǎn)物具有3'-dA突出端，可直接用于TA克隆。

產(chǎn)品組成

本產(chǎn)品分體系中包含溴酚藍、不含溴酚藍兩類(lèi)。體系中包含溴酚藍的產(chǎn)品，PCR擴增產(chǎn)物可直接電泳檢測。這兩類(lèi)產(chǎn)品的擴增性能無(wú)差異。如無(wú)特別說(shuō)明提供體系中包含溴酚藍的包裝。

保存條件

-20℃保存2年。

質(zhì)量控制

純度檢測：經(jīng)質(zhì)量檢測，產(chǎn)品不含脫氧核糖核酸內切酶、脫氧核糖核酸外切酶和核糖核酸酶污染。

功能檢測：PCR方法檢測無(wú)宿主殘余DNA，能有效擴增人基因組中的單拷貝基因。

應用舉例

1.?處理樣品

組織：取3-5mg組織置于1.5ml離心管中，加入180 μl Extraction?Solution，充分渦旋振蕩，95℃溫浴10min。加入20 μl?Neutralization?Solution，充分渦旋振蕩，5,000rpm離心2min，取0.5-2 μl上清進(jìn)行擴增。

頭發(fā)：取兩根帶毛囊的頭發(fā)，剪下帶毛囊的發(fā)根放入1.5ml離心管中，加入180 μl Extraction?Solution，充分渦旋振蕩，95℃溫浴10min。加入20 μl?Neutralization?Solution，充分渦旋振蕩，5000rpm離心2min，取0.5-2 μl上清進(jìn)行擴增。

口腔拭子：取樣前30min內請勿進(jìn)食及飲水，使用無(wú)菌棉簽在口腔內擦拭10次。將棉球剪下置于1.5ml離心管中，加入180 μl Extraction? Solution，充分渦旋振蕩，95℃溫浴10min。加入20 μl?Neutralization?Solution，充分渦旋振蕩，5,000rpm離心2min，取0.5-2 μl上清進(jìn)行擴增。

培養細胞：如果是懸浮培養細胞直接取1×10³-10⁴當量的細胞加入到50 μl?PCR反應體系中即可。如果是貼壁培養細胞，取3-5mg細胞組織置于1.5ml離心管中，加入180 μl Extraction?Solution，充分渦旋振蕩，95℃溫浴10min。加入20 μl?Neutralization?Solution，充分渦旋振蕩，5,000rpm離心2min，取0.5-2 μl上清進(jìn)行擴增。

血液、淋巴液DNA病毒：取100 μl血清或淋巴液至1.5ml離心管中，加入180 μl Extraction?Solution，充分渦旋振蕩，95℃溫浴10min。加入20 μl?Neutralization? Solution，充分渦旋振蕩，12,000rpm離心10min，取0.5-2 μl上清進(jìn)行擴增。

2.?配制反應體系

請于冰上配置反應體系，體系大小與組分用量與添加順序可調整：

[1]?引物終濃度建議范圍：0.1-1 μM。特異性差時(shí)可降低濃度，效率低時(shí)可提高濃度。

[2]?可單獨訂購超純水（Cat. #：P9021/P9022/P9023）。

[3]?可單獨訂購25mM MgCl₂（Cat. #：P9031）和PCR Enhancer（Cat. #：P9041）。

3.?設定反應程序進(jìn)行PCR反應

大多數模板的快速擴增條件：

[1]?退火溫度應根據Tm值較低的引物來(lái)設。

[2]?延伸時(shí)間按20 sec/kb來(lái)設最佳。

1kb簡(jiǎn)單模板的快速擴增條件：

由于1kb簡(jiǎn)單模板的二級結構簡(jiǎn)單，且長(cháng)度較短，可同時(shí)縮短變性、退火時(shí)間至15s，延伸時(shí)間20s，以實(shí)現快速擴增。

4.?分析結果

反應產(chǎn)物可直接進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，通過(guò)凝膠成像設備觀(guān)察目的條帶的擴增情況。如有需要，可進(jìn)行割膠回收。無(wú)產(chǎn)物或產(chǎn)物量少的改進(jìn)措施有：1調整退火溫度；2減少抑制劑的影響，如提取的基因組DNA中含有抑制擴增的成分，需要高倍稀釋?zhuān)?: 10000）后使用；3采用乙醇沉降洗脫，提高模板DNA的純度；4使用PCR添加劑，如PCR Enhancer（Cat. #：P9041）、MgCl₂（Cat. #：P9031）等可提高產(chǎn)量。

操作注意事項

處理的組織樣本往往不會(huì )完全溶解，這是正?，F象。溶解在處理液中的組織樣本足夠滿(mǎn)足FS??Mix Direct for Tissue擴增的需要。

室溫下FS??Taq DNA聚合酶有一定的活性，為避免發(fā)生非特異性擴增，請于冰上配置反應體系，并且最后添加模板DNA。

延伸時(shí)間視片段長(cháng)度而定。一般情況，≤500bp目的片段延伸15s，500bp-1kb延伸20s，＞1kb延伸時(shí)間按20s/kb計算。

FS? Taq DNA聚合酶具有脫氧核苷酸轉移酶活性，因此在PCR產(chǎn)物3’末端通常會(huì )加上一個(gè)多余的脫氧腺嘌呤核苷，可進(jìn)行TA克隆。

FS??Mix Direct for Tissue也可采用常規程序擴增。

引物設計注意事項

引物長(cháng)度一般在15-30個(gè)堿基之間；上下游引物3’末端避免互補，避免出現3個(gè)以上重復的G或C，或出現發(fā)夾結構，否則會(huì )產(chǎn)生非特異性擴增；GC含量控制在40-60%，且上下游引物GC含量盡量接近；Tm值控制在55-65℃之間，且上下游引物Tm值盡量接近，額外附加序列（酶切位點(diǎn)、修飾等）是非模板匹配序列，不參與Tm值計算。

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