Long Taq Mix
Cat. #：P2061，P2062
產(chǎn)品簡(jiǎn)介
Long Taq Mix是2×濃縮的PCR擴增預混和溶液，含有Long Taq DNA聚合酶、dNTPs、緩沖液等PCR擴增必需組分（模板與引物除外）。使用時(shí)，僅需在擴增體系中加入模板和引物即可進(jìn)行PCR，大大簡(jiǎn)化操作過(guò)程，縮短操作時(shí)間，降低污染（加樣次數減少）。同時(shí)，由于體系內含有優(yōu)化劑與增強劑，能夠顯著(zhù)增強PCR擴增的靈敏度。
Long Taq DNA聚合酶是專(zhuān)門(mén)用于擴增長(cháng)片段的嗜熱DNA聚合酶，其保真性是普通Taq DNA聚合酶的3倍左右。擴增片段的長(cháng)度可達20 kb（簡(jiǎn)單模板）。在擴增復雜模板（如GC-rich或重復序列）時(shí)，Long Taq DNA聚合酶的擴增效率顯著(zhù)高于Taq DNA聚合酶。因此Long Taq DNA聚合酶適合＞5kb的DNA片段及復雜模板的擴增。延伸速度為20s/kb（70~75℃，簡(jiǎn)單模板可達5s/kb）。擴增產(chǎn)物具有兩種末端：平末端與3'-dA。
產(chǎn)品組成
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Component |
P2061 |
P2062 |
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2× Long Taq Mix |
1 ml |
1 ml× 3 |
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超純水 |
1 ml |
1 ml× 3 |
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PCR ? Enhancer[1] |
0.5 ml |
0.5 ml× 3 |
本產(chǎn)品分含體系中包含溴酚藍、不含溴酚藍兩類(lèi)。體系中包含溴酚藍的產(chǎn)品，PCR擴增產(chǎn)物可直接電泳檢測。這兩類(lèi)產(chǎn)品的擴增性能無(wú)差異。如無(wú)特別說(shuō)明提供體系中包含溴酚藍的包裝。
[1] PCR Enhancer主要通過(guò)降低DNA模板的解鏈溫度，促進(jìn)DNA模板的有效擴增，增加PCR反應的靈敏度和特異性?？蓡为氂嗁彛–at. #：P9041）。
保存條件
-20℃保存2年。
質(zhì)量控制
純度檢測：經(jīng)質(zhì)量檢測，產(chǎn)品不含脫氧核糖核酸內切酶、脫氧核糖核酸外切酶和核糖核酸酶污染。
功能檢測：PCR方法檢測無(wú)宿主殘余DNA，能有效擴增人基因組中的單拷貝基因。
應用舉例
1.?配制反應體系
請于冰上配置反應體系，體系大小與組分用量與添加順序可調整：
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Ordinal |
Component |
Volume (50 μl reaction volume) |
Final ? concentration (50 μl reaction volume) |
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optional |
PCR Enhancer |
4-16 μl |
- |
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1 |
2×Long Taq Mix |
25 ? μl |
1× |
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2 |
upstream ? primer (10 μM)[1] |
2 μl |
0.4 ? μM |
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3 |
downstream ? primer (10 μM)[1] |
2 μl |
0.4 ? μM |
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4 |
template ? DNA[2] |
1-4 ? μl |
<1μg |
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5 |
超純水[3] |
To ? 50 μl |
- |
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optional |
MgCl2(MgSO4)[4] |
Variable |
- |
[1]?引物終濃度建議范圍：0.1-1 μM。特異性差時(shí)可降低濃度，效率低時(shí)可提高濃度。
[2]?不同模板最佳用量不同，部分DNA模板建議用量如下表（50 μl反應體系）。
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Template |
人類(lèi)基因組DNA |
λDNA |
大腸桿菌基因組DNA |
質(zhì)粒DNA |
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Dosage |
0.1μg-1μg |
0.5ng-5ng |
10ng-100ng |
0.1ng-10ng |
[3]?可單獨訂購超純水（Cat. #：P9021/P9022/P9023）。
[4]?可單獨訂購25mM MgCl2（Cat. #：P9031）。
2.?設定反應程序進(jìn)行PCR反應
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Stage ? |
Temperature |
Time |
Number ? of Cycles |
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Initial ? Denaturation |
94℃ |
3 ? min |
1 |
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Denaturation |
94℃ |
30 ? sec |
25-35 ? |
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Annealing |
55-68℃[1] |
30 ? sec |
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Extension |
72℃ |
Variable[2] |
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Final ? Extension |
72℃ |
5-10 ? min |
1 |
[1]?退火溫度應根據Tm值較低的引物來(lái)設。
[2]?延伸時(shí)間按20s/kb來(lái)設最佳（簡(jiǎn)單模板可達5s/kb）。
3.?分析結果
反應產(chǎn)物可直接進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，通過(guò)凝膠成像設備觀(guān)察目的條帶的擴增情況。如有需要，可進(jìn)行割膠回收。
無(wú)產(chǎn)物或產(chǎn)物量少的改進(jìn)措施有：1調整退火溫度；2減少抑制劑的影響，如提取的基因組DNA中含有抑制擴增的成分，需要高倍稀釋?zhuān)?:；10000）后使用；3采用乙醇沉降洗脫，提高模板DNA的純度；4使用PCR添加劑，如PCR Enhancer（Cat. #：P9041）、MgCl2（Cat. #：P9031）等可提高產(chǎn)量。
操作注意事項
1?室溫下Long Taq DNA聚合酶有一定的活性，為避免發(fā)生非特異性擴增，請于冰上配置反應體系，并且最后添加模板DNA。
2 Long Taq Mix的擴增產(chǎn)物有兩種末端：平末端和3'-dA突出末端。如要進(jìn)行TA克隆，請先進(jìn)行加A反應，以提高克隆效率。（加A反應：參考如下體系，72℃，15-30min）
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PCR（純化）產(chǎn)物 |
1-7 ? μl |
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10× ? Taq Buffer（Mg2+?Plus） |
1 ? μl |
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dATP ? |
0.2 ? mM |
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Taq ? DNA聚合酶 |
5U |
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超純水 |
To ? 10 μl |
3 Long Taq Mix既可擴增長(cháng)片段的DNA，也可擴增小片段（幾百bp）的DNA。
4 PCR Enhancer主要在Long Taq Mix擴增無(wú)結果或擴增效果不好時(shí)使用。使用后退火溫度需在原溫度上降低2-3℃，否則會(huì )降低PCR效率，建議使用Tm值較高的引物。PCR Enhancer能夠與所有的耐熱DNA聚合酶共同作用。
引物設計注意事項
引物長(cháng)度一般在15-30個(gè)堿基之間；上下游引物3’末端避免互補，避免出現3個(gè)以上重復的G或C，或出現發(fā)夾結構，否則會(huì )產(chǎn)生非特異性擴增；GC含量控制在40-60%，且上下游引物GC含量盡量接近；Tm值控制在55-65℃之間，且上下游引物Tm值盡量接近，額外附加序列（酶切位點(diǎn)、修飾等）是非模板匹配序列，不參與Tm值計算。
相關(guān)產(chǎn)品
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名稱(chēng) |
貨號 |
規格 |
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PCR Mix |
P2011/P2012/P2013/P2014/P2015 |
1ml/5ml/10ml/50ml/100ml |
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Pfu Mix |
P2021/P2022 |
1ml/5ml |
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OptimusTM?Hotstart ? Taq DNA聚合酶 |
P1041/P1042/P1043/P1044 |
50μl/200μl/600μl/7.2ml |
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Power Green qPCR Mix |
P2101/P2102/P2103/P2104/P2105 |
1ml/5ml/10ml/50ml/100ml |
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1kb ladder |
M1181/M1182 |
50次/250次 |
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DSTM5000 |
M1111/M1112 |
60次/300次 |
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高純度質(zhì)粒小提試劑盒 |
N1011/N1012/N1013 |
50次/100次/200次 |
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通用RNA提取試劑盒 |
R1051 |
50次 |
|
基因組DNA快速提取試劑盒 |
N1111/N1112 |
50次/100次 |
|
DNA凝膠回收試劑盒 |
N1071/N1072/N1073 |
50次/100次/200次 |
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RT-PCR Kit |
R1011/R1012 |
20次/100次 |
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