要先對PCR目的序列的長(cháng)度有個(gè)大致估計：

第一步：找到Primer3的站點(diǎn)。你不用記住這個(gè)站點(diǎn)，但是要記住“Primer3”這個(gè)詞，然后打開(kāi)GOOGLE首頁(yè)，輸入Primer3，跳出來(lái)的第一個(gè)項目就是了“Primer3 Input 0.4.0 (primer3-web/htdocs/input-040.htm)”

網(wǎng)址是http://frodo.wi.mit.edu/。

第二步：貼上模板序列。進(jìn)入Primer3站點(diǎn)，可以看到一個(gè)引物設計的界面。在“Paste?source sequence?below (5'->3'…..”下面的大空框里面把你的模板序列粘帖進(jìn)去。注意是5'->3'方向的，數字或者空格都沒(méi)關(guān)系，軟件會(huì )自動(dòng)過(guò)濾的。

第三步：重要參數設定。首先是“Product Size Ranges”，如果你不希望軟件給你隨便做的話(huà)，首先要調整的就是這個(gè)參數。默認的參數實(shí)際上是從100到1000，這個(gè)你得自己改，如果你希望產(chǎn)物的大小符合你的預期，盡可能把范圍改小，比如480-500，具體看情況調整。第二個(gè)參數是“Primer Size”，默認值一般可以用，但是，當你用熟了這個(gè)軟件，你自己就知道該怎么改了。第三個(gè)參數是”Primer Tm”這個(gè)和Primer Size差不多。

第四步：Pick primers：?點(diǎn)一下這個(gè)按鈕，符合你大小預期的primer就出來(lái)了，看看Primer3 Output的界面，多么漂亮！你要的primer出來(lái)了，而且有primer在序列上的位置比對圖，還要primer本身的信息，包括位置，長(cháng)度，Tm，GC含量，任何位置互補堿基數，3'端互補堿基數，以及引物序列，（注意，下游引物是5'->3'），還要產(chǎn)物大小，兩引物間任意互補堿基數，兩引物間3'端互補堿基數等。如果引物尚在參數設定的范圍內，但還不是最佳，將會(huì )給出警告。

第五步：引物設計檢驗：可以?xún)H僅設計一向引物，只要在Pick?left?primer或者Pick?right?primer前面的勾勾掉一個(gè)就可以。也可以自己定義引物，放在Primer框里，（注意，下游引物的書(shū)寫(xiě)反向仍然是5'->3'）如果符合設定的條件，軟件將對給出引物評分，同時(shí)給出警告信息，根據警告信息可以適當對自定義引物做些調整即可，警告信息也讓你做實(shí)驗的時(shí)候心中有數。對于文獻發(fā)表的引物，最好都要檢查一下，這樣就可以避免被別人有意無(wú)意誤導。至于RT-PCR所用的引物，最好是使得產(chǎn)物跨過(guò)內含子，這樣避免潛在DNA對RT-PCR的干擾。實(shí)際做引物的時(shí)候，要把內含子都去掉，僅僅把外顯子序列放入源序列框中，并且通過(guò)自定義引物設計的方法，使上下游引物分別全部或者部分落在不同外顯子上。至于如何快速識別內含子和外顯子以及電子PCR，我將抽空另做說(shuō)明。

至于設計出來(lái)的引物的實(shí)際效果，根據我的經(jīng)驗，一般情況下都能做到PCR一次成功，也許隨便那一段序列做引物也能達到很好的效果，但是不管怎么說(shuō)，軟件做引物可以讓自己心中有數。最后，GOOD LUCK TO EVERYONE.