KASP（Kompetitive Allele-Specific PCR，競爭性等位基因特異性PCR）是一種基于PCR的基因分型技術(shù)，主要用于檢測單核苷酸多態(tài)性（SNP）和其他特定基因變異。廣泛應用于農業(yè)育種、醫學(xué)研究、群體遺傳學(xué)等領(lǐng)域。
引物設計開(kāi)發(fā)流程如下
- 獲取SNP信息，要求兩親本在SNP位置的堿基序列不同，同時(shí)該SNP上游20bp、下游40bp無(wú)其他SNP, SNP信息可通過(guò)全基因組測序得到，也可通過(guò)重測序得到；
- 提取親本DNA、F1代DNA并稀釋到5-50ng/ul備用(也可以不稀釋?zhuān)竺鏀U增體系里面用水補齊)；
- 引物設計：
- 從SNP所在堿基開(kāi)始往上游數20bp作為左引物f，SNP的堿基作為左引物的第20個(gè)堿基，于是有左引物f1，f2;
- 使用引物設計軟件或引物設計網(wǎng)站（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/）固定左引物f，通過(guò)blast得到右引物R，產(chǎn)物大小需小于60bp；
- 左引物f1、f2分別加上接頭A1、A2（接頭序列A1：GAAGGTGACCAAGTTCATGCT，A2：GAAGGTCGGAGTCAACGGATT）序列為F1、F2，即F1=A1f1，F2=A2f2；
- 合成序列F1，F2，R，選用ULTRPAGE純化方式；
- 將引物干粉溶解，F1、F2濃度為36uM，R濃度為90 uM，然后三種引物按體積比1:1:1混勻為primer mix；
- 引物篩選：每種引物每個(gè)親本及F1最少跑2個(gè)孔。
PCR擴增體系如下
| component | volume(ul) |
| DNA | 5 |
| KASP PCR MIX | 5 |
| Primer mix | 0.14 |
- 擴增結束后使用熒光定量PCR讀帶：讀帶程序如下：
25℃ for 5s + Plate Read。讀帶完成后，選定熒光類(lèi)型FAM、HEX、ROX,選擇Allelic Discrimination進(jìn)行分析 - 挑選其中聚類(lèi)明顯的引物作為候選標記。
- 將候選標記用于群體，若聚類(lèi)效果明顯則可作為KASP標記，聚類(lèi)效果不明顯則不能作為標記。
一般來(lái)說(shuō)，實(shí)驗初期需要選擇多個(gè)位點(diǎn)設計不同引物進(jìn)行實(shí)際驗證，從中選出聚類(lèi)效果明顯的作為最終的引物用于實(shí)驗。KASP 本身是一個(gè)非常依賴(lài)引物設計的技術(shù)，如果反復優(yōu)化無(wú)果，很可能引物在 SNP 區位的設計可以進(jìn)一步改善。