DNA 電泳是分子生物學(xué)實(shí)驗的“基本功”，幾乎所有科研人員都繞不開(kāi)。雖然操作看似簡(jiǎn)單，但原理與細節不少，一旦忽視就可能導致條帶模糊、結果失真，甚至實(shí)驗“全軍覆沒(méi)”。今天我們來(lái)拆解幾個(gè)常見(jiàn)的誤區，從理論到實(shí)踐，幫你真正理解電泳原理，少走彎路。

???原理回顧：DNA 為什么能“跑起來(lái)”？

DNA電泳過(guò)程示意圖

DNA 電泳依賴(lài)的是?電場(chǎng)驅動(dòng)：帶負電荷的 DNA 分子在電場(chǎng)中向正極遷移。遷移速度主要受以下因素影響：

分子大小：小分子 DNA 在凝膠孔隙中阻力小，遷移更快。

瓊脂糖濃度：濃度越高，凝膠網(wǎng)孔越密，分辨小分子的能力更強。

電壓與緩沖液：電壓過(guò)高會(huì )導致發(fā)熱，緩沖液離子濃度不當會(huì )影響電流與分辨率。

核酸構象：線(xiàn)性 DNA、超螺旋質(zhì)粒、開(kāi)環(huán)質(zhì)粒遷移速度各不相同，超螺旋質(zhì)粒 > 線(xiàn)性 DNA > 開(kāi)環(huán)質(zhì)粒。

超螺旋質(zhì)粒（Supercoiled DNA）構象緊密，分子呈現高度壓縮狀態(tài)。在凝膠孔隙中受到的阻力最小 → 遷移速度最快。

線(xiàn)性 DNA（Linear DNA）構象伸展，遷移速度主要取決于分子大小。一般情況下，速度介于超螺旋和開(kāi)環(huán)之間。

開(kāi)環(huán)質(zhì)粒（Nicked/Relaxed Circular DNA）因單鏈切口導致環(huán)形松弛，構象最“蓬松”。在凝膠中阻力最大 → 遷移速度最慢。

理解這些原理，才能真正避免實(shí)驗中“看不懂”的現象。

???常見(jiàn)誤區一：瓊脂糖濃度隨意配

瓊脂糖是從海藻中提取的一種線(xiàn)性聚合物，加熱溶解后再冷卻會(huì )形成具有網(wǎng)狀結構的凝膠。這個(gè)網(wǎng)絡(luò )就像一個(gè)個(gè)篩孔。

瓊脂糖濃度對遷移率和分辨率的具體影響：

a. 對遷移率（Mobility）的影響

對于同一大小的DNA片段，瓊脂糖濃度越高，其受到的阻力越大，遷移速度越慢。反之，濃度越低，遷移越快。

因此，在不同濃度的凝膠上，同一個(gè)DNA片段的遷移位置是不同的，不能直接比較。

b. 對分辨率（Resolution）的影響

分辨率是指將大小相近的DNA片段分離開(kāi)的能力。這是瓊脂糖濃度最重要的影響。

• 低濃度凝膠（如0.5%-0.8%）：

篩孔大，允許大片段DNA（>10 kb）有效分離。小片段DNA跑得飛快，但彼此之間難以分開(kāi)，會(huì )擠在一起形成模糊的一條帶。

優(yōu)點(diǎn)：適合分離大片段DNA。

缺點(diǎn)：凝膠非常脆弱柔軟，容易破損。

• 中等濃度凝膠（如0.8%-2.0%）：

這是最常用的范圍，提供了一個(gè)良好的平衡，能有效分離0.5 kb - 10 kb范圍內的DNA片段，足以滿(mǎn)足大多數常規實(shí)驗（如質(zhì)粒、PCR產(chǎn)物、酶切產(chǎn)物的鑒定）。

1%與1.7%瓊脂糖凝膠外觀(guān)對比

1%與1.7%瓊脂糖凝膠分辨率對比

M1: 100bp Ladder;?M2: DS2000;?M3: DS5000;?M4: 1kb Ladder

 

• 高濃度凝膠（如2%-3%）：

篩孔小，能很好地分離小片段DNA（<1 kb），甚至能分辨出幾十個(gè)堿基對的差異。大片段DNA則幾乎無(wú)法移動(dòng)，停留在加樣孔附近。

優(yōu)點(diǎn)：對小片段DNA分辨率極高。

缺點(diǎn)：凝膠脆性大，易碎。

?? 濃度錯誤直接導致分辨率下降，大片段跑不動(dòng)，小片段跑成一團。

 

???常見(jiàn)誤區二：電壓越高越好

瓊脂糖凝膠電泳里電壓是個(gè)很關(guān)鍵的因素，直接影響到DNA/RNA 遷移速度、條帶清晰度和分離效果。

1. 電壓與遷移速度

• 高電壓 → 分子遷移更快：電場(chǎng)力更強，帶負電的核酸分子快速向正極移動(dòng)。

• 低電壓 → 遷移較慢：分離過(guò)程更溫和，條帶移動(dòng)較慢。

2. 電壓與分辨率

• 低電壓（常用 4–6 V/cm）：遷移慢，但小片段與大片段的分離效果更好，分辨率高，適合區分相鄰大小的條帶。

• 高電壓（>10 V/cm）：條帶跑得快，但容易拉寬、拖尾，分辨率下降。

4V/cm、7V/cm、9V/cm電壓分辨率對比

M1: 100bp Ladder;?M2: DS2000

3. 電壓與熱效應

• 高電壓 → 產(chǎn)生焦耳熱：緩沖液升溫，凝膠變軟甚至熔化，導致條帶彎曲（smiling bands，笑臉效應）。

• 散熱不足：DNA 遷移速率不均勻，上下條帶彎曲，DNA降解，影響結果準確性。

• 解決辦法：降低電壓，或者在低溫條件下電泳（冰盒、電泳槽加冰袋）。

9V/cm電壓下不同電泳時(shí)間對比

M3: DS5000;?M4: 1kb Ladder

4. 實(shí)驗常用電壓范圍

• 常規瓊脂糖凝膠（0.7–2%）：4–10 V/cm（電壓與電泳槽兩電極間距離有關(guān)）。

• 小片段 DNA 分離（幾十到幾百 bp）：可稍高電壓（8–10 V/cm）。

• 大片段 DNA（>10 kb）：應低電壓（3–5 V/cm），防止擴散和分辨率丟失。

電壓越高，電泳越快，但分辨率和凝膠完整性可能受影響；低電壓遷移慢，卻能獲得更清晰、更可靠的分離效果。

?? 推薦?5–10 V/cm，電極間距 20 cm 時(shí)，電壓保持在 100–200 V 之間。

???常見(jiàn)誤區三：只靠上樣染料定位

上樣緩沖液是DNA電泳中不可或缺的組成部分，它通常含有兩種主要成分：

1. 惰性染料（如溴酚藍、二甲苯青）：用于實(shí)時(shí)監控電泳進(jìn)程。
2. 增稠劑（如甘油、蔗糖、Ficoll）：增加樣品密度，確保樣品沉入加樣孔底部。

染料在電泳中起到了“視覺(jué)參考線(xiàn)”或“前鋒”的作用，其定位功能主要體現在：

1. 指示電泳進(jìn)程，統一上樣基準。
2. 預估DNA片段的遷移位置：
   • 不同的染料在不同濃度的瓊脂糖凝膠中，其遷移行為與特定大小的DNA片段相似。因此，它們可以用來(lái)粗略估計未知DNA條帶的大小。
   • 溴酚藍（Blue：在0.8%-1.0%的瓊脂糖凝膠中，其遷移速度大約與300-500 bp的DNA片段相當。
   • 二甲苯青（Blue：在0.8%-1.0%的瓊脂糖凝膠中，其遷移速度大約與4000-5000 bp的DNA片段相當。
   • 例如：?如果你看到溴酚藍條帶快跑出凝膠了，你就知道所有小于500 bp的DNA片段可能已經(jīng)接近凝膠底部，即將跑出。

???不能憑染料位置判斷片段大小，這也是為什么 DNA Marker 在電泳中不可或缺。

???常見(jiàn)誤區四：Marker 隨便用

在分子生物學(xué)實(shí)驗中，DNA Marker常被簡(jiǎn)單視為泳道中的“對照”或“標尺”，但它的作用遠不止于此。Marker的選擇直接決定了實(shí)驗數據的可解釋性、準確性和美觀(guān)度，是實(shí)驗設計中最容易被忽視卻至關(guān)重要的一環(huán)。一個(gè)不合適的Marker可能導致整個(gè)實(shí)驗結果失去價(jià)值。

低質(zhì)量或不匹配Marker帶來(lái)的三大問(wèn)題：

1. 片段分布稀疏：導致大小判斷“失準”
   • 問(wèn)題：?當Marker的條帶間隔過(guò)大，或恰好在你目標片段的關(guān)鍵區域缺少條帶時(shí)，你無(wú)法進(jìn)行精確的插值估算。例如，如果你的PCR產(chǎn)物在750 bp左右，而Marker僅在500 bp和1000 bp有條帶，你只能模糊地估計產(chǎn)物大小在“500到1000 bp之間”，無(wú)法得出準確結論。
   • 后果：?實(shí)驗數據的精確度大打折扣，無(wú)法滿(mǎn)足克隆鑒定、酶切驗證等對大小要求嚴格的實(shí)驗需求。
2. 條帶模糊拖尾：影響結果呈現與可信度
   • 問(wèn)題：?由于保存不當、反復凍融或生產(chǎn)工藝問(wèn)題，Marker條帶可能出現擴散、模糊或強度不均（有的亮有的暗）。這不僅影響觀(guān)察，更嚴重影響成像質(zhì)量。
   • 后果：?在論文、報告或展示中，模糊的Marker會(huì )讓整個(gè)實(shí)驗結果顯得不專(zhuān)業(yè)、不可靠，降低數據的可信度。審稿人或同行可能會(huì )因此質(zhì)疑你的實(shí)驗嚴謹性。
3. 缺少關(guān)鍵指示條帶：降低實(shí)驗效率
   • 問(wèn)題：?許多高效能的Marker會(huì )在500 bp、1000 bp、1500 bp和2000 bp等關(guān)鍵位置設置特別亮、特別粗的“指示條帶”或“參考條帶”。
   • 后果：?缺少這些指示條帶，你在快速瀏覽凝膠時(shí)就無(wú)法瞬間定位。你需要花費額外的時(shí)間去數條帶、比對大小，大大降低了實(shí)驗分析的效率。尤其在處理多個(gè)樣品時(shí)，這種效率損失尤為明顯。

如何選擇一個(gè)“合理”的Marker？

一個(gè)優(yōu)秀的Marker不應只是DNA片段的簡(jiǎn)單集合，而應是一個(gè)精心設計的測量工具。以下是選擇標準：

???1. 覆蓋合適的片段范圍
這是最基本的要求。選擇的Marker其條帶范圍必須將你的目標DNA片段“包圍”在中間，而不是落在兩端。例如：

• 常規PCR產(chǎn)物鑒定（100 bp - 2 kb）：?選擇范圍覆蓋100 bp至2000 bp的Ladder，如著(zhù)名的100 bp Plus Ladder或1 kb Plus Ladder。
• 大片段酶切或基因組DNA分析（>5 kb）：?應選擇λ DNA HindIII digest等大片段Marker。
• 小片段 miRNA/siRNA 分析（<100 bp）：?需要專(zhuān)門(mén)的低分子量Marker。

???2. 條帶清晰、濃度均一

• 清晰銳利：?每條帶都應邊界清晰，無(wú)拖尾或擴散現象，這表明生產(chǎn)工藝好且保存得當。
• 亮度均一：?理想狀態(tài)下，所有條帶應具有相近的亮度（即DNA含量一致），這確保了不同大小的條帶都能被清晰成像，不會(huì )出現小條帶看不見(jiàn)、大條帶又過(guò)曝的情況。

???3. 含有突出的指示條帶，便于快速定位

• 這是區分“優(yōu)秀”Marker和“普通”Marker的關(guān)鍵。許多高端Marker會(huì )特意將500 bp和1000 bp（有時(shí)還包括1500 bp和2000 bp）的條帶做得更濃、更亮。
• 好處：?在紫外燈下，你的眼睛能立刻抓住這幾個(gè)“地標”，瞬間建立起凝膠的空間距離與分子大小的對應關(guān)系，無(wú)需仔細數格子，極大提升了判讀效率。

???常見(jiàn)誤區五：忽略緩沖液與染料差異

在瓊脂糖凝膠電泳中，新手往往將全部注意力集中在瓊脂糖濃度和電壓設置上，而忽略了兩個(gè)同樣至關(guān)重要的因素：電泳緩沖體系和核酸染料。它們并非“通用”的試劑，其選擇直接影響DNA的遷移率、條帶分辨率和實(shí)驗安全性，錯誤的選擇會(huì )悄然破壞你的實(shí)驗結果。

一、電泳緩沖液：不僅僅是導電的溶液

最常用的緩沖液是TAE和TBE，它們化學(xué)成分不同，決定了其特性和適用場(chǎng)景截然不同。

?? 如何選擇？

• 首選TAE的情況：?進(jìn)行大片段DNA分離（如基因組DNA酶切）、DNA膠回收（兼容性更好）或需要快速電泳時(shí)。
• 首選TBE的情況：?進(jìn)行小片段DNA分離（如PCR產(chǎn)物、SSR分析）、高分辨率電泳（如區分相差幾十bp的條帶）或需要長(cháng)時(shí)間電泳時(shí)。

?? 重要提示：絕對不可將TAE和TBE緩沖液或其濃縮母液混用！?這會(huì )導致pH和離子強度異常，產(chǎn)生不可預測的遷移結果。

二、核酸染料：安全與效能的權衡

染料的選擇關(guān)乎實(shí)驗結果的清晰度和操作者的生命安全。

?? 如何選擇？

• 追求成本與靈敏度：?可能仍在用EB染料，但必須配備嚴格的防護和廢物處理流程。

• 追求安全與便捷（現代實(shí)驗室首選）：AIE-Gelgreen或GelRed是更安全的選擇，尤其適合教學(xué)實(shí)驗室或沒(méi)有專(zhuān)門(mén)EB處理設施的實(shí)驗室。它們通常與藍光成像系統配套，能最大程度減少對DNA的損傷（UV會(huì )使DNA產(chǎn)生嘧啶二聚體，影響下游實(shí)驗）。
• 注意：?如果實(shí)驗下游需要進(jìn)行膠回收克隆，建議選擇對酶活影響更小的染料。

總結與實(shí)驗設計指南

忽略緩沖液和染料的選擇，就像用錯誤的尺子和昏暗的燈光去測量一個(gè)精細的零件。

?? 在設計實(shí)驗時(shí)，請遵循這個(gè)流程進(jìn)行選擇：

• 看片段大?。?/strong>
  • 大片段(>5 kb)?→ 優(yōu)先選TAE緩沖液。
  • 小片段(<1 kb)?→ 優(yōu)先選TBE緩沖液，以獲得更高分辨率。
• 看實(shí)驗目的：
  • 常規鑒定?→ 可選擇性?xún)r(jià)比高的方案（如DSView染料、EB染料）。
  • 膠回收?→ 優(yōu)先選TAE?+?對酶活無(wú)抑制的染料（如AIE-Gelgreen）。
  • 發(fā)表級高清圖片?→ 優(yōu)先選高分辨率緩沖液(TBE)?+?高靈敏度/低背景的染料（如AIE-Gelgreen）。

AIE-Gelgreen核酸凝膠染料

• 看安全性與成本：
  • 安全絕對優(yōu)先?→ 毫不猶豫地選擇AIE-Gelgreen等安全染料和藍光成像系統，即使成本稍高。
  • 權衡遷移準確性 → 如果擔心某些染料影響遷移，可在Marker和樣品中使用完全相同的上樣緩沖液和染料負載，以消除誤差。

因此，將緩沖液和染料視為與凝膠濃度、電壓同等重要的核心實(shí)驗參數，根據你的具體需求進(jìn)行理性選擇，是獲得可靠、美觀(guān)、安全實(shí)驗結果的必備步驟。

 

??小結

DNA 電泳看似“基礎”，卻暗藏不少原理性細節。掌握濃度、電壓、緩沖液、Marker 與染料的選擇規律，才能保證結果：

• 條帶清晰

• 分辨率高

• 實(shí)驗可重復、可展示

 

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