PCR（聚合酶鏈式反應）幾乎是分子實(shí)驗室里最常見(jiàn)的技術(shù)之一。但有時(shí)候，做著(zhù)做著(zhù)，條帶就是不上鏡：要么無(wú)條帶，要么全是拖尾，要么陰性對照還神奇地亮了……??
別急！今天我們就來(lái)盤(pán)點(diǎn) PCR失敗的5個(gè)常見(jiàn)原因，并提供實(shí)用的解決辦法，幫你少踩坑。
1???模板DNA質(zhì)量或濃度不合適
?? 表現：無(wú)條帶、條帶過(guò)弱或拖尾。
????? 原因：DNA降解、雜質(zhì)殘留，或者濃度過(guò)低/過(guò)高。
? 解決辦法：
- 保證DNA純度（A260/A280 = 1.8–2.0）；
- 稀釋過(guò)濃模板；
- 植物/土壤等樣本建議用高純度提取試劑盒。
2???引物設計或濃度有問(wèn)題
???表現：非特異性條帶、引物二聚體。
???原因：引物設計不合理，濃度過(guò)高/過(guò)低。
??解決辦法：
-
長(cháng)度18–25 bp，GC含量40–60%；
-
避免3’端互補；
-
終濃度一般0.1–0.5 μM，必要時(shí)做梯度PCR優(yōu)化。
3???PCR體系或酶活性問(wèn)題
???表現：完全無(wú)擴增或擴增效率低。
???原因：Taq酶失活、Mg2?濃度不合適、dNTP降解。
??解決辦法：
-
分裝保存酶，避免反復凍融；
-
優(yōu)化Mg2?濃度（1.5–2.5 mM）；
-
用新鮮dNTP；
-
推薦選擇性能優(yōu)異的PCR預混液??? 預混液中已優(yōu)化了緩沖體系和酶活性，能顯著(zhù)提升擴增成功率，減少反復調試的時(shí)間，非常適合常規科研實(shí)驗。
4???實(shí)驗操作污染
???表現：陰性對照也出現條帶。
???原因：PCR產(chǎn)物殘留、移液槍污染、空氣中DNA污染。
??解決辦法：
-
嚴格分區操作（提取區/體系配置區/產(chǎn)物分析區分開(kāi)）；
-
用帶濾芯的槍頭；
-
定期清潔實(shí)驗臺，使用核酸去除劑。
5???循環(huán)條件設置不當
???表現：條帶模糊、非特異性擴增或無(wú)結果。
???原因：退火溫度過(guò)低/過(guò)高、延伸時(shí)間不足、循環(huán)數過(guò)多。
??解決辦法：
-
根據引物Tm值設置退火溫度；
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延伸時(shí)間約 1 kb/min；
-
循環(huán)數控制在30–35次。
???總結
PCR失敗并不可怕，常見(jiàn)問(wèn)題主要集中在?模板、引物、體系、操作和循環(huán)條件?這五個(gè)方面。逐一排查，總能找到原因。
而對于高校實(shí)驗室或科研人員來(lái)說(shuō)，選擇一款高性能PCR預混液，往往能讓PCR事半功倍，節省大量試錯時(shí)間。
?? 科研路上，少一點(diǎn)彎路，多一點(diǎn)高效！
| 貨號 | 產(chǎn)品名稱(chēng) | 適用場(chǎng)景 |
| P2141 | Super TaqMix | 常規PCR擴增 |
| P2111 | Super HIFI PCR Master Mix | 長(cháng)片段高保真擴增 |
| P2121 |
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| P2091 | SYBR Green qPCR Mix | 染料法高特異性基因定量分析 |
| P2701 | Multiplex Probe qPCR Mix Plus U | 探針?lè )ǘ嗷蛲瑫r(shí)定量檢測 |
| R1081 | PowerScript RT SuperMix | 全預混高效RNA逆轉錄 |
| RP1001B | 2X One Step RT-PCR Mix | 快速逆轉錄與PCR擴增一體化 |
| V5007 | 2X One Step Prime RT-qPCR Mix | 快速靈敏的轉錄組基因定量檢測 |
| P9013 |
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| R1021 | TRAzol | 高效提取高質(zhì)量RNA |
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